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非洲(zhou)豬瘟病(bing)毒(du)熒光PCR檢測試劑盒操作步驟

  獸用

【獸藥名(ming)稱】

通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光PCR檢(jian)測試劑盒

漢語(yu)拼音：Feizhou zhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe

英(ying)文(wen)名稱：African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit

商品名稱：無

【主要成(cheng)分(fen)與含量】

【作用與用途】  用于血液、血球粉、淋巴結(jie)、脾臟、扁桃體中非(fei)洲豬瘟(wen)病毒核酸的檢測(ce)。

【用法與判定(ding)】

1 用法

1.1 樣品處理

血液(ye)樣品直接用；淋巴結、脾臟、扁(bian)桃體(ti)樣品，用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品2.0 g于研缽中充(chong)分研磨，再加10.0 mL PBS（pH 7.2，含1萬單位青霉(mei)素和1萬單位鏈霉(mei)素）用MixMax漩渦振蕩(dang)器混勻（樣(yang)品不(bu)足2.0 g按1:5比例加PBS），對處理(li)的待(dai)檢樣品置(zhi)70℃，30分鐘滅活后，3 000 r/min，4 ℃離心5分鐘，取(qu)上清液，編(bian)號備用；血球(qiu)粉(fen)處理同上，只不過省掉(diao)研磨(mo)步驟。

1.2 樣品存放

采集(ji)或處理好的樣品(pin)在2℃～8℃條件下保(bao)存(cun)應不超過24 h；若需長期保存，須(xu)放(fang)置(zhi)-80 ℃冰箱，但應避免(mian)反復凍融（凍融不超(chao)過3次）。

1.3 操作步驟

1.3.1 病毒(du)DNA的(de)提(ti)取（使用A盒(he)）

（1）待檢樣(yang)品、陽性對照和陰性對照的份數總和用n表示，取n個滅菌的1.5 mL離心管(guan)，逐管(guan)編號。

（2）每管加(jia)入Buffer A 500 mL。

（3）每(mei)管分別加入已處理的待檢樣品、陽性對(dui)照、陰性對(dui)照各200 mL，充分混(hun)勻(yun)，室溫(wen)放置10分鐘(zhong)。

（4）取與上述離心管等量的(de)DNase-Free吸附柱(zhu)和收集管(guan)，編號(hao)。將離心管(guan)中(zhong)的溶液(ye)轉移至DNase-Free吸附柱(zhu)(zhu)，（為避免堵塞(sai)吸附柱(zhu)(zhu)，盡量不(bu)要吸懸(xuan)浮雜質）。

（5）用TH-15高(gao)速(su)離心(xin)機設置13000 r/min室溫離心(xin)30秒。

（6）棄去收集管液體(ti)，將吸附柱放回(hui)收集管中。

（7）吸附柱內加入600 μL Buffer B，13000 r/min離心(xin)30秒。

（8）棄(qi)去(qu)收(shou)集管液(ye)體，將吸附柱放(fang)回收(shou)集管中。

（9）重(zhong)復步驟（7），（8）。

（10）13000 r/min空柱離心2分鐘，去除(chu)殘(can)留(liu)液。

（11）將每個(ge)吸附柱(zhu)分別移(yi)入新的1.5mL離心管中，向柱中央(yang)加入50 μL Buffer C，室溫靜置1分鐘，13000 r/min離心(xin)30秒，離(li)心管中液體即為模(mo)板DNA。獲得的DNA溶液，冰上保(bao)存備(bei)用（注意提取的DNA須在2 h內進行PCR 擴增(zeng)，若需長期保(bao)存須放置-80 ℃冰箱，但(dan)應(ying)避(bi)免(mian)反復凍融）。

1.3.2 熒光PCR擴增(zeng)（使用B盒）

（1）從試劑盒中(zhong)取出熒光PCR反應液、Taq酶，室溫融(rong)化后(hou)，2 000 r/min離心(xin)5秒。設所需PCR管數為n（n = 樣本數(shu)+1管陰性對照+1管陽性對照），每(mei)個(ge)測(ce)試反應(ying)體(ti)系(xi)需(xu)要20 μL 熒光PCR反應液和(he)0.5 μL Taq酶(mei)。計算好各試劑的使用量，加(jia)入一適(shi)當體積小管(guan)中，充分(fen)混合均勻后，向每(mei)個PCR管(guan)中各分裝(zhuang)20 μL。

（2）分別(bie)向上述PCR管中加入1.3.1（11）中制備(bei)的DNA溶(rong)液(ye)各5μL，蓋(gai)緊(jin)管蓋(gai)，500 r/min 離心30秒。

（3）將(jiang)加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測(ce)儀內，作好標記。反應參(can)數(shu)設置：

階段，預變性95℃/3分鐘

第(di)二階段，95℃/15秒(miao)，52℃/10秒，60℃/35秒共45個循環。熒光收集(ji)在第(di)二階段每(mei)次循環的(de)60℃延伸時(shi)進行。

2 判定

2.1 結(jie)果分析條(tiao)件的設定

閾(yu)值設(she)定原則：根據儀器噪(zao)聲情(qing)況進行調整，以(yi)閾(yu)值線(xian)剛好超過陰性對照品擴增曲線(xian)的高點為準。對于多通道熒光PCR儀，選定FAM(465-510)檢測通道讀(du)取檢測結果，ABI儀器選擇(ze)FAM無熒光淬滅基團。

2.2 質控標準

2.2.1 陰性對(dui)照無Ct值并且無擴增曲線(xian)。

2.2.2 陽性對照的Ct值應小于等于28，并出(chu)現典型的擴增(zeng)曲線。

2.2.3 如(ru)陰(yin)性(xing)(xing)和(he)陽性(xing)(xing)對(dui)照不滿足(zu)以(yi)上條(tiao)件，此次實驗視為無效。

2.3 結果判定

2.3.1 陰性：無Ct值，且(qie)無特(te)征性(xing)擴增曲線(xian)，表明(ming)樣品為陰(yin)性(xing)。

2.3.2 陽性：Ct值(zhi)≤38.0，且出現典型的擴增曲(qu)線，表示樣品為陽性。

2.3.3 Ct值大(da)于38.0，且出現(xian)典型的(de)擴增曲線(xian)的(de)樣(yang)品建議復驗(yan)(yan)。復驗(yan)(yan)仍出現(xian)上(shang)述結果的(de)，判為(wei)(wei)陽性，否則判為(wei)(wei)陰性。

【注意事項】

1 實驗室應(ying)至少分三個區(qu)：樣品(pin)處理區(qu)、反應(ying)混合物(wu)配制區(qu)和(he)檢(jian)測區(qu)。

2 各(ge)區物品均為，不得交叉使用(yong)，避免污染(ran)。檢測(ce)結(jie)束后，應(ying)立即(ji)對工作(zuo)臺進行清潔。

3 Buffer A有很(hen)強的腐蝕性，切勿沾到皮膚(fu)或衣服(fu)上(shang)，否則應立即(ji)用大量清水(shui)沖洗并(bing)擦干。

4 在(zai)整個檢測過程中應注意避(bi)(bi)免交(jiao)叉污染：提取核(he)酸時(shi)應用滅菌的鑷子(zi)夾取離(li)心管；對離(li)心管開蓋時(shi)應避(bi)(bi)免粘在(zai)手上或(huo)濺(jian)出，否則(ze)要(yao)立即更(geng)換手套。

5 反(fan)應液(ye)在使用前(qian)要*融化，并將反(fan)應液(ye)與Taq酶瞬時離心將液體(ti)(ti)甩至管底。分裝反應液時，應盡量避免(mian)產生氣泡。上機(ji)前注意檢查各反應管是(shi)否(fou)蓋(gai)緊，以(yi)免(mian)熒光物質(zhi)泄露污(wu)染儀器(qi)。

6 陽性對照(zhao)在吸取(qu)前應在微量漩渦(wo)振蕩器上劇烈振蕩1～2秒。

7 試劑盒中各(ge)組(zu)分(fen)應避免反復凍(dong)融(rong)。

8 對樣品及其廢棄物的操作應嚴格遵守(shou)生物安全規定。

9 本(ben)試(shi)劑盒僅(jin)供獸醫及相關專業人(ren)士使用。

【貯藏與有效期】  非洲豬瘟(wen)病毒熒光(guang)PCR檢測試劑(ji)盒的A盒室(shi)溫(wen)保(bao)存，B盒在-20℃保存(cun)，有效期為12個(ge)月。

【規格(ge)】  48檢測/盒